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前言

維生素B1又稱(chēng)硫胺素或抗神經(jīng)炎維生素或抗腳氣病維生素，由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過(guò)亞甲基結合而成的一種B族維生素。維生素B1主要存在于種子的外皮和胚芽中，如米糠和麩皮中含量很豐富，在酵母菌中含量也極豐富。瘦肉、白菜和芹菜中含量也較豐富。所用的維生素B1都是化學(xué)合成的產(chǎn)品。在體內，維生素B1以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護神經(jīng)系統的作用；還能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，增加食欲。維生素B1缺乏時(shí)，可引起多種神經(jīng)炎癥，如腳氣病。維生素B1缺乏所引起的多發(fā)性神經(jīng)炎，患者的周?chē)窠?jīng)末梢有發(fā)炎和退化現象，并伴有四肢麻木、肌肉萎縮、心力衰竭、下肢水腫等癥狀。在現代醫學(xué)上，維生素B1制劑治療腳氣病和多種神經(jīng)炎癥有顯著(zhù)療效。

實(shí)驗部分

儀器、試劑與材料

主要儀器設備

高效液相色譜儀-熒光檢測器

試劑材料

正丁醇、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸鈉、氯化鈣均為分析純；

冰乙酸、甲醇為色譜純

維生素B1標準品（純度99%）：鹽酸硫胺素，CAS 67-03-8；

木瓜蛋白酶：應不含維生素B1，酶活力≥800 U（活力單位）/mg；

淀粉酶：應不含維生素B1，酶活力≥3700 U/g；

20 g/L鐵氰化鉀溶液：稱(chēng)取2 g鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL，搖勻；

100 g/L氫氧化鈉溶液：稱(chēng)取25 g氫氧化鈉，用水溶解并定容至250 mL，搖勻；

堿性鐵氰化鉀溶液：將5 mL上述鐵氰化鉀溶液與200 mL上述氫氧化鈉溶液混合，搖勻；

0.1 mol/L鹽酸溶液：移取8.5 mL鹽酸，加水稀釋至1000 mL，搖勻；

0.01 mol/L鹽酸溶液：量取0.1 mol/L鹽酸溶液50 mL，用水稀釋并定容至500 mL，搖勻；

0.05 mol/L乙酸鈉溶液：稱(chēng)取6.08 g乙酸鈉，加900 mL水溶解，用冰乙酸調節pH為4.0 ~ 5.0之間，加水定容至1000 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后使用；

2.0 mol/L乙酸鈉溶液：稱(chēng)取27.2 g乙酸鈉，用水溶解并定容至100 mL，搖勻；

混合酶溶液：稱(chēng)取1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶，加水定容至50 mL，渦旋，使呈混懸狀液體，冷藏保存。

樣品制備

樣品提取

稱(chēng)取3 g ~ 5 g固體試樣或者10 g ~ 20 g液體試樣于100 mL錐形瓶中（帶有軟質(zhì)塞子），加60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質(zhì)塞子，高壓滅菌鍋中121℃保持30 min。水解結束待冷卻至40℃取出，輕搖數次，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調節pH至4.0左右，加入2 mL（可根據酶活力不同適當調整用量）混合酶溶液，搖勻后，置于培養箱中37℃過(guò)夜（約16 h），將酶解液全部轉移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，離心或者過(guò)濾，取上清液備用。

樣品衍生化

準確移取上述上清液或者濾液2 mL于10 mL試管中，加入1 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后，準確加入2 mL正丁醇，再次渦旋混勻1.5 min后靜置約10 min或者離心，待充分分層后，吸取正丁醇相（上層）經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液于2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，待檢測。若樣品中維生素B1濃度超出線(xiàn)性范圍的最高濃度值，應取上清液稀釋適宜倍數后，重新衍生后進(jìn)樣。

實(shí)驗條件

液相條件

色譜柱：Venusil® XBP C18(2)  5 μm， 4.6 × 250 mm，100 ?

流動(dòng)相：0.05 mol/L乙酸鈉溶液︰甲醇 = 65︰35

熒光檢測器檢測波長(cháng)：激發(fā)波長(cháng)375 nm，發(fā)射波長(cháng)435 nm

流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL

結果與討論

實(shí)驗結果

經(jīng)圖1、圖2可知，采用Venusil XBP C18(2)色譜柱檢測嬰幼兒配方奶粉中的維生素B1，峰形良好，保留時(shí)間穩定，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗要求。

圖1 維生素B1標準溶液

圖2 嬰幼兒配方奶粉中的維生素B1

結論

本實(shí)驗依據GB 5009.84-2016第一法，用Venusil XBP C18(2)（5 μm，100 ?，4.6 × 250 mm）檢測嬰幼兒配方奶粉中的維生素B1，并結合液相色譜-熒光檢測器對樣品進(jìn)行了檢測，結果維生素B1保留時(shí)間穩定，峰形良好，說(shuō)明Venusil XBP C18(2)（5 μm，100 ?，4.6 × 250 mm）能夠用于嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的檢測。

注意事項

按照國標法進(jìn)行樣品前處理時(shí)回收率較低，可采用先熱超聲提取，再經(jīng)過(guò)酸沉淀蛋白后直接衍生化的方法加以改善。熱超聲時(shí)要注意溫度的控制，以防止維生素B1遭到破壞。

因維生素B1為強極性化合物實(shí)驗中應注意流動(dòng)相比例的確定，且流動(dòng)相的pH對出峰時(shí)間影響較大，因此在每次開(kāi)始實(shí)驗前，要調節流動(dòng)相pH 值到相同的值。

附：相關(guān)產(chǎn)品

應用編號：AF10010