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    使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D
    發(fā)布日期:2019-03-29

    25-羥基維生素D,簡(jiǎn)稱(chēng)25-OH VD,包括25-羥基維生素D2(25-OH VD2)和25-羥基維生素D3(25-OH VD3)作為維生素D在體內的主要代謝形式之一,由于其半衰期長(cháng)、存在形式穩定而被認為是維生素D營(yíng)養水平的標志物。如何快速準確檢測人體內維生素D的水平越來(lái)越受到廣大學(xué)者和醫患人員的重視。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有特異性強、準確性高的特點(diǎn),被認為是評價(jià)維生素D營(yíng)養狀況的"黃金標準"測定法。本應用案例采用Cleanert SLE 96孔板進(jìn)行血清樣品前處理,并使用LC-MS/MS進(jìn)行樣品測試,結果表明該實(shí)驗方法具有良好的穩定性及可靠性,可為臨床研究提供一種解決方案。

    目標物信息

    使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D

    材料及儀器

    Cleanert SLE 96孔板(300mg/well)、Cleanert M96 生物樣品前處理儀、Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀、96孔接收板及Durashell C18-L(3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?)均來(lái)自天津博納艾杰爾科技有限公司;LC-MS/MS, QTRAP 5500(SCIEX);25-OH VD2,25-OH VD3,d3-25-OH VD2以上三種標準品由合作單位提供贊助;d6-25-OH VD3(購自Altascientific);甲醇;甲酸;水;氫氧化鈉;異辛烷。

    樣品處理方法

    樣品預處理

    取100 μL血清至潔凈樣品瓶中,加入內標溶液,再加入100 μL 50 mM氫氧化鈉水溶液混勻后待凈化。

    SLE過(guò)程

    上樣:把預處理的樣品全部上樣,待全部浸潤后靜置5 min。

    洗脫:用2 mL的異辛烷進(jìn)行洗脫,每次洗脫加入500 μL,最后一步洗脫結束,將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上,開(kāi)啟壓力至0.02 MPa,約30 s,完全收集洗脫液。

    將洗脫液室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進(jìn)行溫和氮吹干,使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水(8/2)復溶,進(jìn)樣檢測。

    儀器檢測條件

    HPLC條件

    色譜柱:Durashell C18-L(3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?)

    流速:500 μL/min

    柱溫:30 ℃

    進(jìn)樣量:5 μL

    表1 液相條件

    Step

    Total Time(min)

    Flow Rate(μL/min)

    0.1%甲酸 水 (%)

    0.1%甲酸甲醇 (%)

    0

    0

    500

    10

    90

    1

    3.5

    500

    10

    90

    質(zhì)譜條件

    掃描模式:電噴霧電離正模式

    采集模式:多反應監測(MRM)

    表2 參數信息

    化合物

    保留時(shí)間/min

    Q1

    Q3

    CE

    25-OH VD2

    1.81

    413.3

    395.3

    13.5

    413.3

    355.4

    14.1

    d3-25-OH VD2

    1.79

    416.5

    398.4

    12.3

    416.5

    358.5

    15

    25-OH VD3

    1.71

    401.5

    383.5

    13.8

    401.5

    365.5

    15.1

    d6-25-OH VD3

    1.69

    407.5

    389.5

    13.8

    407.5

    371.5

    15.1

    結果

    線(xiàn)性范圍與靈敏度

    使用不含目標物的血清樣品配制10個(gè)不同濃度的校準曲線(xiàn)點(diǎn),25-OH VD2的濃度分別為:2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/mL;25-OH VD3的濃度分別為:1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/mL;所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進(jìn)行檢測,獲得結果見(jiàn)表3。

    表3 線(xiàn)性范圍及靈敏度

    化合物

    回歸方程

    相關(guān)系數(r2

    方法定量限LOQ(ng/mL)

    25-OH VD2

    y=0.00691x+0.043

    0.9998

    1.1

    25-OH VD3

    y=0.0203x+0.398

    0.9995

    0.16

    方法精密度與準確度

    為考察方法精密度與準確度,取低、中、高三個(gè)濃度的樣本,每個(gè)濃度平行處理5個(gè)樣,獲得數據見(jiàn)表4.

    表4 精密度與準確度

    化合物

    加標濃度
    ng/mL

    平均回收率
    n=5

    RSD
    n=5

    25-OH VD2

    4

    101.8%

    8.3%

    30

    95.6%

    7.2%

    200

    96.8%

    4.0%

    25-OH VD3

    2

    100.4%

    12.9%

    15

    95.0%

    6.1%

    100

    93.5%

    4.3%

    色譜圖

    將經(jīng)Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進(jìn)行測試,獲得譜圖見(jiàn)圖3-4.

    血樣中大量存在的磷脂是造成液質(zhì)聯(lián)用基質(zhì)效應的主要原因,為考察PPT、LLE與Cleanert SLE技術(shù)去除磷脂的能力,特取磷脂兩對特征離子對進(jìn)行考察:496/184, 524/184,獲得對比圖見(jiàn)圖5-6.

    使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D

    圖3 25-OH VD3血清加標色譜圖(濃度為15 ng/mL)

    圖4 25-OH VD2血清加標色譜圖(濃度為30 ng/mL)

    圖5 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對比譜圖(離子對496/184)

    圖6 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對比譜圖(離子對524/184)

    結論

    本應用呈現了一種簡(jiǎn)單、高效的樣品前處理方法,通過(guò)Cleanert SLE 96孔板可高通量?jì)艋獦硬⑤腿「患苄跃S生素D代謝物25-OH VD2與25-OH VD3,本實(shí)驗方法易操作且穩定,可在臨床研究及藥物代謝領(lǐng)域替代耗時(shí)、低效的液液萃取技術(shù)。

    訂貨信息表

    產(chǎn)品名稱(chēng)

    規格/包裝

    訂貨號

    Cleanert SLE 96孔板

    96孔板

    HC2002SQ-9W

    Cleanert M96 生物樣品前處理儀

    96孔板匹配

    SPE-M96

    Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀

    96孔板匹配

    NV-96G

    96孔收集板

    2 mL/well,與96孔板匹配

    96SP2036-2

    Durashell C18-L

    3.0*50mm,5μm,150 ?

    DC950503-L

    甲醇

    LC-MS,   4*2.5L

    LC230

    LC-MS級,4*2.5L/

    LC365

    應用編號:YB10011

    在線(xiàn)客服
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