<dfn id="w82eg"></dfn>
河北來(lái)復醫藥科技有限公司
聯(lián)系電話(huà)：0311-68058422、88662277
地 址：石家莊市高新區長(cháng)江街道天山大街51號久福大廈8樓818
維生素A對人體多種器官的發(fā)育以及人體正常生理機能的維護有不可或缺的作用，然而過(guò)量攝入維生素A會(huì )引發(fā)毒副作用；維生素E作為一種抗氧化劑在體內的主要功能是保護細胞的生物膜結構，最近發(fā)現維生素E也能調控基因表達，維生素E缺乏癥雖少見(jiàn)，卻與新生兒發(fā)育不良和遺傳代謝病相關(guān)。因此，準確測定人體內維生素A與維生素E具有重要意義。維生素A與維生素E由于化學(xué)性質(zhì)活潑，易被氧化，對這類(lèi)物質(zhì)的準確定量具有很大的挑戰。
本應用案例介紹一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，采用Cleanert SLE 96孔板凈化血漿樣品，從血漿樣品中萃取富集維生素A（視黃醇，VA）、α-生育酚（α-VE）和γ-生育酚（γ-VE），實(shí)驗方法具有良好的穩定性及可靠性，可為VA、VE臨床研究提供一種解決方案。
目標物信息
材料及儀器
Cleanert SLE 96孔板（200μL/well），Cleanert M96 生物樣品前處理儀，Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀，96孔收集板，Bonshell C18（2.1*100 mm, 2.7 μm），以上產(chǎn)品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；LC-MS/MS, API 4000+（SCIEX）；VA、α-VE、γ-VE、d6-α-VE、d4-γ-VE（以上5種標準品購自altascientific）；d6-VA（購自BUCHEM BV）；甲醇；甲酸；水；異辛烷；異丙醇；2, 6-二叔丁基對甲酚。
樣品處理方法
樣品預處理
由于VA與VE穩定性差，為防止被氧化，在實(shí)驗中需要加入抗氧化劑，所用抗氧化劑為2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）。
取100 μL血漿至潔凈樣品瓶中，加入內標溶液，再加入50 μL異丙醇和50 μL水溶液，渦旋振蕩混勻。
SLE過(guò)程
上樣：將預混合好的溶液全部上樣，靜置5 min；
洗脫：2 mL 異辛烷/異丙醇 (9/1，含1 g/L BHT)洗脫，每次加入500 μL，分四次洗脫，合并洗脫液；最后一步洗脫結束，將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上，開(kāi)啟壓力至0.005 MPa，約30 s，完全收集洗脫液。
將洗脫液在室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進(jìn)行溫和氮吹干，再使用500μL 0.1%甲酸甲醇（含1 g/L BHT）復溶，進(jìn)樣檢測。
儀器檢測條件
HPLC條件
色譜柱：Bonshell C18（2.1*100 mm, 2.7 μm）
流速：200 μL/min
柱溫：30 ℃
進(jìn)樣量：5 μL
流動(dòng)相條件：100%有機相（0.1%甲酸甲醇）等度分離6min
質(zhì)譜條件
掃描模式：電噴霧電離正模式
采集模式：多反應監測（MRM）
表1 參數信息
|
化合物 |
保留時(shí)間/min |
Q1 |
Q3 |
CE |
|
VA |
1.87 |
269.3 |
93.1 |
31 |
|
269.3 |
81.2 |
23 |
||
|
d6-VA |
1.85 |
274.3 |
88 |
33 |
|
274.3 |
212.3 |
27 |
||
|
α-VE |
4.3 |
431.5 |
165.1 |
25 |
|
431.5 |
137 |
57 |
||
|
d6-α-VE |
4.25 |
437.4 |
171.1 |
26 |
|
437.4 |
110.9 |
26 |
||
|
γ-VE |
3.79 |
417.5 |
151.2 |
25 |
|
417.5 |
304.3 |
14 |
||
|
d4-γ-VE |
3.76 |
421.6 |
155.1 |
26 |
|
421.6 |
111.1 |
22 |
結果
線(xiàn)性范圍與靈敏度
根據目標物在人體內的含量范圍確定標準曲線(xiàn)濃度范圍，試驗中使用不含目標物的血漿樣品配制7個(gè)不同濃度的校準曲線(xiàn)點(diǎn)，VA的濃度分別為：0.05、0.15、0.3、0.5、0.8、1、5 μg/mL；α-VE的濃度分別為：1、2、4、8、10、20、25 μg/mL；γ-VE的濃度分別為：0.2、0.5、1、1.5、3、4.5、8 μg/mL；所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進(jìn)行檢測，獲得結果見(jiàn)表2。
表2 線(xiàn)性范圍及靈敏度
|
化合物 |
回歸方程 |
相關(guān)系數（r2） |
方法定量限LOQ(μg/mL) |
|
VA |
y = 1.3073x + 0.5242 |
0.9963 |
0.012 |
|
α-VE |
y = 1.5237x + 0.1241 |
0.9914 |
0.022 |
|
γ-VE |
y = 2.744x + 0.0425 |
0.9979 |
0.034 |
方法精密度與準確度
為考察方法精密度與準確度，取低、中、高三個(gè)濃度的樣本，每個(gè)濃度平行處理6個(gè)樣，獲得數據見(jiàn)表3.
表3 精密度與準確度
| 化合物 |
加標濃度μg/mL |
平均回收率（n=6） |
RSD（n=6） |
|
VA |
0.15 |
99.6% |
6.9% |
|
0.5 |
94.7% |
7.4% |
|
|
1 |
95.4% |
1.7% |
|
|
α-VE |
2 |
92.1% |
9.6% |
|
8 |
107.1% |
6.6% |
|
|
20 |
93.0% |
4.9% |
|
|
γ-VE |
0.5 |
101.3% |
3.5% |
|
1.5 |
112.2% |
6.8% |
|
|
4.5 |
104.5% |
3.7% |
色譜圖
將經(jīng)Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進(jìn)行測試，獲得譜圖見(jiàn)圖4-6.
血樣中大量存在的磷脂是造成液質(zhì)聯(lián)用基質(zhì)效應的主要原因，為考察Cleanert SLE技術(shù)去除磷脂的能力，特取磷脂兩對特征離子對同時(shí)進(jìn)行考察：496/184，524/184，獲得譜圖見(jiàn)圖7.
圖4 VA血漿加標色譜圖（濃度為0.15μg/mL）
圖5 α-VE血漿加標色譜圖（濃度為2μg/mL）
圖6 γ-VE血漿加標色譜圖（濃度為0.5μg/mL）
圖7 血漿加標樣磷脂色譜圖
結論
本應用介紹了一種簡(jiǎn)單、高效的樣品前處理方法，通過(guò)Cleanert SLE 96孔板可高通量?jì)艋獦硬⑤腿「患苄跃S生素A與維生素E，本實(shí)驗方法易操作且穩定，可在臨床研究及藥物代謝領(lǐng)域替代耗時(shí)、低效的液液萃取技術(shù)。
訂貨信息表
|
產(chǎn)品名稱(chēng) |
規格/包裝 |
訂貨號 |
|
Cleanert SLE 96孔板 |
96孔板，200μL/well |
HC2002-9W |
|
Cleanert M96 生物樣品前處理儀 |
與96孔板匹配 |
SPE-M96 |
|
Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀 |
與96孔板匹配 |
NV96-G-S |
|
96孔收集板 |
2mL/well，與96孔板匹配 |
96SP2036-Y |
|
Bonshell C18 |
2.1*100mm，2.7μm |
SC921002-0 |
|
甲醇 |
LC-MS級, 4*2.5L |
LC230 |
|
水 |
LC-MS級，4*2.5L/箱 |
LC365 |
應用編號：YB10016
上一篇： 使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D
下一篇： 維生素檢測
版權所有© 河北來(lái)復醫藥科技有限公司
技術(shù)支持：七星網(wǎng)路
