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    維生素檢測/application當前位置: 首頁(yè) ? 行業(yè)應用 ? 臨床檢測研究 ? 維生素檢測 ? 正文
    基于Cleanert SLE高通量萃取血漿中維生素A與維生素E
    發(fā)布日期:2019-03-29

    維生素A對人體多種器官的發(fā)育以及人體正常生理機能的維護有不可或缺的作用,然而過(guò)量攝入維生素A會(huì )引發(fā)毒副作用;維生素E作為一種抗氧化劑在體內的主要功能是保護細胞的生物膜結構,最近發(fā)現維生素E也能調控基因表達,維生素E缺乏癥雖少見(jiàn),卻與新生兒發(fā)育不良和遺傳代謝病相關(guān)。因此,準確測定人體內維生素A與維生素E具有重要意義。維生素A與維生素E由于化學(xué)性質(zhì)活潑,易被氧化,對這類(lèi)物質(zhì)的準確定量具有很大的挑戰。

    本應用案例介紹一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法,采用Cleanert SLE 96孔板凈化血漿樣品,從血漿樣品中萃取富集維生素A(視黃醇,VA)、α-生育酚(α-VE)和γ-生育酚(γ-VE),實(shí)驗方法具有良好的穩定性及可靠性,可為VA、VE臨床研究提供一種解決方案。

    目標物信息

    基于Cleanert SLE高通量萃取血漿中維生素A與維生素E

    材料及儀器

    Cleanert SLE 96孔板(200μL/well),Cleanert M96 生物樣品前處理儀,Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀,96孔收集板,Bonshell C18(2.1*100 mm, 2.7 μm),以上產(chǎn)品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品;LC-MS/MS, API 4000+(SCIEX);VA、α-VE、γ-VE、d6-α-VE、d4-γ-VE(以上5種標準品購自altascientific);d6-VA(購自BUCHEM BV);甲醇;甲酸;水;異辛烷;異丙醇;2, 6-二叔丁基對甲酚。

    樣品處理方法

    樣品預處理

    由于VA與VE穩定性差,為防止被氧化,在實(shí)驗中需要加入抗氧化劑,所用抗氧化劑為2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)。

    取100 μL血漿至潔凈樣品瓶中,加入內標溶液,再加入50 μL異丙醇和50 μL水溶液,渦旋振蕩混勻。

    SLE過(guò)程

    上樣:將預混合好的溶液全部上樣,靜置5 min;

    洗脫:2 mL 異辛烷/異丙醇 (9/1,含1 g/L BHT)洗脫,每次加入500 μL,分四次洗脫,合并洗脫液;最后一步洗脫結束,將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上,開(kāi)啟壓力至0.005 MPa,約30 s,完全收集洗脫液。

    將洗脫液在室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進(jìn)行溫和氮吹干,再使用500μL 0.1%甲酸甲醇(含1 g/L BHT)復溶,進(jìn)樣檢測。

    儀器檢測條件

    HPLC條件

    色譜柱:Bonshell C18(2.1*100 mm, 2.7 μm)

    流速:200 μL/min

    柱溫:30 ℃

    進(jìn)樣量:5 μL

    流動(dòng)相條件:100%有機相(0.1%甲酸甲醇)等度分離6min

    質(zhì)譜條件

    掃描模式:電噴霧電離正模式

    采集模式:多反應監測(MRM)

    表1 參數信息

    化合物

    保留時(shí)間/min

    Q1

    Q3

    CE

    VA

    1.87

    269.3

    93.1

    31

    269.3

    81.2

    23

    d6-VA

    1.85

    274.3

    88

    33

    274.3

    212.3

    27

    α-VE

    4.3

    431.5

    165.1

    25

    431.5

    137

    57

    d6-α-VE

    4.25

    437.4

    171.1

    26

    437.4

    110.9

    26

    γ-VE

    3.79

    417.5

    151.2

    25

    417.5

    304.3

    14

    d4-γ-VE

    3.76

    421.6

    155.1

    26

    421.6

    111.1

    22

    結果

    線(xiàn)性范圍與靈敏度

    根據目標物在人體內的含量范圍確定標準曲線(xiàn)濃度范圍,試驗中使用不含目標物的血漿樣品配制7個(gè)不同濃度的校準曲線(xiàn)點(diǎn),VA的濃度分別為:0.05、0.15、0.3、0.5、0.8、1、5 μg/mL;α-VE的濃度分別為:1、2、4、8、10、20、25 μg/mL;γ-VE的濃度分別為:0.2、0.5、1、1.5、3、4.5、8 μg/mL;所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進(jìn)行檢測,獲得結果見(jiàn)表2。

    表2 線(xiàn)性范圍及靈敏度

    化合物

    回歸方程

    相關(guān)系數(r2)

    方法定量限LOQ(μg/mL)

    VA

    y = 1.3073x + 0.5242

    0.9963

    0.012

    α-VE

    y = 1.5237x + 0.1241

    0.9914

    0.022

    γ-VE

    y = 2.744x + 0.0425

    0.9979

    0.034

    方法精密度與準確度

    為考察方法精密度與準確度,取低、中、高三個(gè)濃度的樣本,每個(gè)濃度平行處理6個(gè)樣,獲得數據見(jiàn)表3.

    表3 精密度與準確度

    化合物

    加標濃度μg/mL

    平均回收率(n=6)

    RSD(n=6)

    VA

    0.15

    99.6%

    6.9%

    0.5

    94.7%

    7.4%

    1

    95.4%

    1.7%

    α-VE

    2

    92.1%

    9.6%

    8

    107.1%

    6.6%

    20

    93.0%

    4.9%

    γ-VE

    0.5

    101.3%

    3.5%

    1.5

    112.2%

    6.8%

    4.5

    104.5%

    3.7%

    色譜圖

    將經(jīng)Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進(jìn)行測試,獲得譜圖見(jiàn)圖4-6.

    血樣中大量存在的磷脂是造成液質(zhì)聯(lián)用基質(zhì)效應的主要原因,為考察Cleanert SLE技術(shù)去除磷脂的能力,特取磷脂兩對特征離子對同時(shí)進(jìn)行考察:496/184,524/184,獲得譜圖見(jiàn)圖7.

    基于Cleanert SLE高通量萃取血漿中維生素A與維生素E

    圖4 VA血漿加標色譜圖(濃度為0.15μg/mL)

    圖5 α-VE血漿加標色譜圖(濃度為2μg/mL)

    圖6 γ-VE血漿加標色譜圖(濃度為0.5μg/mL)

    圖7 血漿加標樣磷脂色譜圖

    結論   

    本應用介紹了一種簡(jiǎn)單、高效的樣品前處理方法,通過(guò)Cleanert SLE 96孔板可高通量?jì)艋獦硬⑤腿「患苄跃S生素A與維生素E,本實(shí)驗方法易操作且穩定,可在臨床研究及藥物代謝領(lǐng)域替代耗時(shí)、低效的液液萃取技術(shù)。

    訂貨信息表

    產(chǎn)品名稱(chēng)

    規格/包裝

    訂貨號

    Cleanert   SLE 96孔板

    96孔板,200μL/well

    HC2002-9W

    Cleanert M96 生物樣品前處理儀

    與96孔板匹配

    SPE-M96

    Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀

    與96孔板匹配

    NV96-G-S

    96孔收集板

    2mL/well,與96孔板匹配

    96SP2036-Y

    Bonshell C18

    2.1*100mm,2.7μm

    SC921002-0

    甲醇

    LC-MS級, 4*2.5L

    LC230

    LC-MS級,4*2.5L/箱

    LC365

    應用編號:YB10016

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