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    Cleanert PPT應用于人血清中溶血磷脂酰膽堿的檢測
    發(fā)布日期:2019-03-28

    背景

    溶血磷脂酰膽堿(lyso-Phosphatidylcholines,LPCs)是磷脂的一種,具有多種生理功能,與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常等代謝性疾病和心血管疾病密切相關(guān)。LPCs主要在肝臟代謝,在肝臟疾病和肝毒性中可發(fā)生明顯變化;近年來(lái),學(xué)者們對多種肝臟疾病和化學(xué)性肝毒性模型的大量研究均涉及了LPCs。

    本應用案例介紹一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法,采用Cleanert PPT 96孔板凈化人血清樣品,從血清樣品中富集LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0五種溶血磷脂酰膽堿,該方法具有良好的穩定性及可靠性,可為溶血磷脂酰膽堿臨床研究提供一種解決方案。

    材料及儀器

    Cleanert PPT 蛋白沉淀板,Cleanert M96 生物樣品前處理儀,Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀,96孔收集板,Durashell C18(L)(3.0*50 mm, 5 μm,150?),以上產(chǎn)品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品;LC-MS/MS, API 4000+(SCIEX);LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0(以上5種標準品購自Avanti);利血平(內標);甲醇;甲酸;水;生理鹽水(0.9%);甲酸銨。

    樣品處理方法

    樣品混合

    由于難以獲得不含目標物的基質(zhì),本實(shí)驗使用生理鹽水代替人血清進(jìn)行方法學(xué)驗證試驗。為保護人血中溶血磷脂酰膽堿,試驗中使用的甲醇均含有0.1% 2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)。

    標準曲線(xiàn)及重現性試驗中,基質(zhì)為生理鹽水,試驗中取20μL生理鹽水,加入5μL 標準工作液,渦旋混合均勻,待下一步凈化。

    人血清加標試驗中,取20μL血清,加入5μL 標準工作液,渦旋混合均勻,待下一步凈化。

    蛋白沉淀過(guò)程

    先向Cleanert PPT每孔中加入150μL甲醇(含100ppb利血平),再加入預混合的樣品,渦旋混合均勻,靜置10min,使用Cleanert M96將溶液收集至潔凈收集板內。

    Cleanert V96溫度設定為30℃,將收集板里的溶液氮吹干,使用1mL 80%甲醇水復溶,渦旋混合均勻,進(jìn)樣測試。

    儀器檢測條件

    HPLC條件

    色譜柱:Durashell C18(L) (3.0*50mm 5um 150?)

    流速:800uL/min

    柱溫:30℃

    進(jìn)樣量:5 μL

    流動(dòng)相條件

    Total Time(min)

    0.1%甲酸25mM甲酸銨-水   (%)

    0.1%甲酸-甲醇(%)

    0

    70

    30

    0.5

    50

    50

    1

    0

    100

    4

    0

    100

    4.1

    70

    30

    5

    STOP

    質(zhì)譜條件

    掃描模式:電噴霧電離正模式

    采集模式:多反應監測(MRM)

    表2 參數信息

    目標物

    tR/min

    Q1

    Q3

    DP

    CE

    利血平

    2

    609.3

    448.2

    140

    40

    609.3

    195*

    120

    45

    C14:0

    2.46

    468.4

    285.3

    110

    40

    468.4

    450.4*

    120

    27

    C15:0

    2.54

    482.3

    299.5

    120

    36

    482.3

    464.2*

    120

    28

    C16:0

    2.63

    496.4

    478.2*

    124

    16

    C17:0

    2.72

    510.4

    327.2

    120

    30

    510.4

    492.4*

    120

    20

    C18:0

    2.83

    524.5

    341.5

    115

    28

    524.5

    506.2*

    127

    18

    注:*為定量離子對

    結果

    線(xiàn)性范圍與靈敏度為考察方法線(xiàn)性范圍,配置系列標準工作液,取5μL標準工作液至20μL生理鹽水中進(jìn)行前處理操作,獲得的樣品濃度參見(jiàn) 3中S1~S7,曲線(xiàn)方程等信息參見(jiàn)表3.

    表3 標準曲線(xiàn)濃度及線(xiàn)性關(guān)系

    項目

    C14:0

    C15:0

    C16:0

    C17:0

    C18:0

    S1/ppm

    0.125

    0.25

    3.75

    0.375

    2.5

    S2/ppm

    0.25

    0.5

    7.5

    0.75

    5

    S3/ppm

    0.5

    1

    15

    1.5

    10

    S4/ppm

    1.25

    2.5

    37.5

    3.75

    25

    S5/ppm

    2.5

    5

    75

    7.5

    50

    S6/ppm

    3.75

    7.5

    112.5

    11.25

    75

    S7/ppm

    7.5

    15

    225

    22.5

    150

    曲線(xiàn)方程

    y=0.725x+0.00264

    y=0.212x-0.0256

    y=0.212x+0.268

    y=0.366x+0.00653

    y=0.31x+0.287

    相關(guān)系數

    0.9965

    0.9913

    0.9956

    0.9938

    0.9961

    LOQ/ppm

    0.027

    0.12

    0.32

    0.059

    0.072

    方法精密度與準確度

    實(shí)驗中取生理鹽水為基質(zhì),進(jìn)行兩個(gè)濃度(S3,S5)的加標回收率實(shí)驗,分別進(jìn)行兩個(gè)平行樣,結果見(jiàn)表4.

    為考察方法精密度與準確度,取濃度水平為S3與S5分別進(jìn)行8個(gè)樣品的平行試驗,S3對應LQC,S5對應HQC,基質(zhì)為生理鹽水,實(shí)驗獲得的數據見(jiàn)表5。

    表4 生理鹽水基質(zhì)加標回收率數據

    項目

    C14:0

    C15:0

    C16:0

    C17:0

    C18:0

    低加標濃度/ppm

    1.25

    2.5

    37.5

    3.75

    25

    高加標濃度/ppm

    3.75

    7.5

    113

    11.3

    75

    低-實(shí)測濃度-1/ppm

    1.29

    2.28

    38.1

    3.31

    24.3

    低-實(shí)測濃度-2/ppm

    1.44

    2.85

    43

    4.09

    28.1

    低-回收率-1

    103.2%

    91.2%

    101.6%

    88.3%

    97.2%

    低-回收率-2

    114.4%

    114.0%

    114.7%

    109.1%

    112.4%

    高-實(shí)測濃度-1/ppm

    3.44

    6.77

    102

    9.83

    69.9

    高-實(shí)測濃度-2/ppm

    3.35

    6.53

    103

    9.94

    69

    高-回收率-1

    91.7%

    90.3%

    90.3%

    87.0%

    93.2%

    高-回收率-2

    89.3%

    87.1%

    91.2%

    88.0%

    92.0%

    表5 生理鹽水基質(zhì)精密度與準確度數據

    項目

    C14:0

    C15:0

    C16:0

    C17:0

    C18:0

    LQC平均回收率(n=8)

    96.3%

    99.9%

    103.6%

    96.6%

    100.0%

    CV(n=8)

    6.3%

    6.4%

    8.5%

    7.1%

    7.0%

    HQC平均回收率(n=8)

    96.8%

    99.1%

    97.5%

    93.8%

    97.7%

    CV(n=8)

    11.3%

    12.1%

    12.3%

    12.0%

    11.3%

    由表4及表5可見(jiàn),此方法可用于處理及檢測生理鹽水基質(zhì)中的溶血磷脂酰膽堿,為進(jìn)一步考察方法對于血清樣本的適應性,特取人血清進(jìn)行加標回收率考察,獲得數據見(jiàn)表6.由于人血清中含有濃度可觀(guān)的溶血磷脂酰膽堿,實(shí)驗檢測兩份人血清樣品用于扣除內源性溶血磷脂酰膽堿,加標回收率計算公式為:

      Cleanert PPT應用于人血清中溶血磷脂酰膽堿的檢測

    CA—加標樣實(shí)測濃度

    CM—人血清樣品平均濃度

    CS—加標濃度

    表6 人血清基質(zhì)實(shí)驗數據

    項目

    C14:0

    C15:0

    C16:0

    C17:0

    C18:0

    低加標濃度/ppm

    1.25

    2.5

    37.5

    3.75

    25

    高加標濃度/ppm

    3.75

    7.5

    113

    11.3

    75

    人血清樣品-1/ppm

    0.827

    2.46

    107

    2.92

    47.3

    人血清樣品-2/ppm

    0.678

    2.21

    92

    2.45

    39.4

    低-實(shí)測濃度-1/ppm

    1.97

    4.5

    140

    6.24

    72

    低-實(shí)測濃度-2/ppm

    2.17

    4.99

    136

    6.67

    70

    低-回收率-1

    97.4%

    86.6%

    108.0%

    94.8%

    114.6%

    低-回收率-2

    113.4%

    106.2%

    97.3%

    106.3%

    106.6%

    高-實(shí)測濃度-1/ppm

    4.8

    9.46

    196

    13.8

    113

    高-實(shí)測濃度-2/ppm

    4.72

    9.69

    216

    14.8

    122

    高-回收率-1

    107.9%

    95.0%

    85.4%

    98.4%

    92.9%

    高-回收率-2

    105.3%

    98.1%

    103.1%

    107.2%

    104.9%


    Cleanert PPT應用于人血清中溶血磷脂酰膽堿的檢測

    圖1 標準曲線(xiàn)S2點(diǎn)色譜圖

    圖2 人血樣品色譜圖

    實(shí)驗結論

    本應用使用蛋白沉淀的方式對生理鹽水及人血清進(jìn)行前處理,并使用LC-MS/MS檢測溶血磷脂酰膽堿,結果表明本方法簡(jiǎn)單、穩定、易操作,可快速處理檢測人血清中溶血磷脂酰膽堿含量,用于臨床研究。

    實(shí)驗所用產(chǎn)品列表

    產(chǎn)品名稱(chēng)

    規格/包裝

    訂貨號

    Cleanert PPT

    96孔板,1mL/well

    96CD1025-M

    Cleanert M96 生物樣品前處理儀

    與96孔板匹配

    SPE-M96

    Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀

    與96孔板匹配

    NV-96G

    96孔收集板

    2mL/well,與96孔板匹配

    96SP2036-Y

    Durashell C18(L)

    3.0*50mm,5μm,150?

    DC950503-L

    甲醇

    LC-MS級,   4*2.5L

    LC230

    LC-MS級,4*2.5L/箱

    LC365

    在線(xiàn)客服
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