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河北來(lái)復醫藥科技有限公司
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糖皮質(zhì)激素是臨床常用的一類(lèi)藥物，對皮膚病有良好的消炎作用，可抑制纖維細胞增生，減少5-羥色胺的形成，因此其在短時(shí)間使用對皮膚有一定的嫩白作用【1】。但長(cháng)期使用則會(huì )發(fā)生皮膚變薄、毛細血管擴張、毛囊萎縮，一旦停用，皮膚就會(huì )發(fā)紅、發(fā)癢，出現紅斑、皮疹等。因此我國《化妝品衛生規范》【2】明確規定此類(lèi)物質(zhì)為禁用成分。目前糖皮質(zhì)激素的檢測多集中在藥品中有效成分和尿液中糖皮質(zhì)激素的檢測【3-7】，化妝品中糖皮質(zhì)激素的檢測文獻報道的較少。本文采用CLearnert PEP-2 SPE凈化的方法，建立了一種化妝品中潑尼松、潑尼松龍、可的松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松、醋酸可的松、醋酸潑尼松、醋酸氫化可的松、曲安奈德11種糖皮質(zhì)激素同時(shí)檢測的方法。
實(shí)驗方法
.實(shí)驗試劑和材料
糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物標準品（詳見(jiàn)表1）
表1 糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物標準品信息
|
中文名 |
英文名 |
CAS號 |
相對分子質(zhì)量 |
|
潑尼松龍 |
Prednisone |
50-24-8 |
360.1937 |
|
氫化可的松 |
Hydrocortisone |
50-23-7 |
362.2093 |
|
潑尼松 |
Prednisone |
53-03-2 |
358.1780 |
|
可的松 |
Cortisone |
53-06-5 |
360.1937 |
|
甲基潑尼松龍 |
MethyLprednisoLone |
83-43-2 |
374.2093 |
|
倍他米松 |
Betamethasone |
378-44-9 |
392.1999 |
|
地塞米松 |
Dexamethasone |
50-02-2 |
392.1999 |
|
曲安奈德 |
TriamcinoLone acetonide |
76-25-5 |
434.2105 |
|
氫化可的松醋酸酯 |
Hydrocortisone 21-acetate |
50-03-3 |
404.2200 |
|
潑尼松醋酸酯 |
Prednisone 21-acetate |
125-10-0 |
400.1886 |
|
可的松醋酸酯 |
Cortisone 21-acetate |
50-04-4 |
402.2042 |
實(shí)驗試劑（詳見(jiàn)表2）
|
試劑名稱(chēng) |
品牌 |
規格 |
|
甲醇 |
霍尼韋爾 |
質(zhì)譜純，2.5L/瓶 |
|
乙腈 |
霍尼韋爾 |
質(zhì)譜純，2.5L/瓶 |
|
水 |
霍尼韋爾 |
質(zhì)譜純，2.5L/瓶 |
儀器和設備（詳見(jiàn)表3）
|
設備名稱(chēng) |
品牌 |
規格/型號 |
|
串聯(lián)質(zhì)譜儀 |
AB SCIEX |
API 4000+ |
|
高效液相色譜儀 |
安捷倫 |
1260 |
|
VenusiLTM ASB C18液相色譜柱 |
天津博納艾杰爾科技 |
2.1×150mm 3μm 150A |
|
分析型柱溫箱 |
天津博納艾杰爾科技 |
>室溫5℃~70℃ |
|
12位固相萃取裝置 |
天津博納艾杰爾科技 |
12位 |
|
CLeanertTM PEP-2 固相萃取小柱 |
天津博納艾杰爾科技 |
500 mg/6 mL |
|
針式過(guò)濾器（尼龍） |
天津博納艾杰爾科技 |
0.22 um，13 mm |
|
分析天平 |
賽多利斯 |
0.1mg，220g |
|
高速離心機 |
上海華亭 |
50mL*6 |
|
渦旋振蕩器 |
Vortex-genie |
230/240VAC 50HZ |
|
氮吹儀 |
天津博納艾杰爾科技 |
15位 |
糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物標準溶液配制
標準貯備液
分別精密稱(chēng)取適量的12種糖皮質(zhì)激素標準品，用甲醇溶解定容，分別配制成1 000μg/mL的貯備液。-20℃以下保存。
混合標準工作液
準確量取糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物標準貯備液適量，用20%乙腈水溶液稀釋成適宜濃度的混合標準工作液，現配現用。
實(shí)驗試劑的配置
10%亞鐵氰化鉀溶液：稱(chēng)量2.3g K4Fe(CN)6?3H2O，用水溶解定容至20mL；
20%乙酸鋅溶液：稱(chēng)量4.78g C4H6O4Zn?2H2O，用水溶解定容至20mL；
定容液：量取70mL水和30mL乙腈，混勻后加入100uL甲酸混勻。
測定步驟
提取
霜膏類(lèi)化妝品：稱(chēng)取0.2 g試樣于50mL離心管，混勻。加入3 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混合使樣品分散，加入2mL乙腈，超聲提取5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上層清液于另一50 mL離心管中，下層氯化鈉溶液用2mL乙腈重復提取一次，合并二次乙腈提取液，往提取液加入40mL去離子水，混勻，加入亞鐵氰化鉀溶液0.2mL，混勻，加入乙酸鋅溶液0.2mL，混勻，8000r/min離心10min，作為待進(jìn)化液。
精油類(lèi)樣品：稱(chēng)取0.5g試樣（精確至0.01g）于50 mL離心管，混勻。加入4 mL正己烷，渦旋混合使樣品分散，加入4 mL 50%乙腈水溶液，渦旋提取2 min，8000 r/min離心5min，吸取下層提取液，上層正己烷用4 mL 50%乙腈水溶液重復上述提取步驟一次，合并二次50%乙腈提取液，往提取液加入36 mL去離子水，混合，加入亞鐵氰化鉀溶液0.1mL，混勻，加入乙酸鋅溶液0.1mL，混勻，8000r/min離心10 min，作為待進(jìn)化液。
凈化
將PEP-2固相萃取小柱接上固相萃取裝置，小柱上端緊密連接一個(gè)60 mL裝有篩板的上樣管，小柱預先用5 mL甲醇、10 mL水活化。將上述待凈化液全部上樣，待樣品溶液自然流盡后，再用10 mL 10%乙腈水溶液淋洗小柱，待清洗液自然流盡后，取下上樣管，用吸球吹出小柱中的殘留液。用6mL甲醇洗脫小柱，待甲醇自然流盡后，用吸球吹出小柱中的殘留液，收集洗脫液于40℃氮氣吹干，用1 mL定容液溶解定容，過(guò)0.22 um尼龍濾膜，待測。
液相色譜條件
色譜柱：VenusiL ASB C18，3μm，150 ?，2.1*150mm；
流動(dòng)相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脫程序見(jiàn)表4；
柱溫：30℃；
進(jìn)樣量：10μL。
表4 流動(dòng)相梯度洗脫條件和流速
|
時(shí)間/min |
流速/μL/min |
A相/% |
B相/% |
|
0.00 |
200 |
68 |
32 |
|
3.00 |
200 |
68 |
32 |
|
10.00 |
200 |
25 |
75 |
|
15.00 |
200 |
15 |
85 |
|
15.01 |
200 |
68 |
32 |
|
25.00 |
200 |
68 |
32 |
質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測；
IS：-4500V；
GS1：55Psi；
GS2：55Psi；
TEM：550℃；
糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物多反應監測的優(yōu)化參數見(jiàn)表5。
表5 糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物多反應監測的優(yōu)化參數
|
藥物名稱(chēng) |
保留時(shí)間/min |
監測離子對 |
DP |
EP |
CE |
CXP |
|
潑尼松龍 |
6.22 |
405.1/329.1 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
|
|
405.1/359.2 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
氫化可的松 |
6.35 |
407.2/331.1 |
-30 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
|
|
407.2/361.1 |
-30 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
潑尼松 |
6.29 |
403.1/326.9 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
|
|
403.1/357.2 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
可的松 |
6.66 |
405.1/329.1 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
|
|
405.1/359.2 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
甲基潑尼松龍 |
9.02 |
419.2/343.0 |
-40 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
|
|
419.2/373.0 |
-40 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
倍他米松 |
9.55 |
437.2/361.3 |
-60 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
|
|
437.2/391.1 |
-65 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
地塞米松 |
10.04 |
437.2/361.3 |
-60 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
|
|
437.2/391.1 |
-65 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
曲安奈德 |
12.22 |
479.1/413.4 |
-60 |
-10 |
-24 |
-11 |
|
|
|
479.1/337.1 |
-40 |
-10 |
-24 |
-11 |
|
氫化可的松醋酸酯 |
12.9 |
449.2/403.0 |
-50 |
-10 |
-16 |
-11 |
|
|
|
449.2/373.0 |
-50 |
-10 |
-16 |
-11 |
|
潑尼松醋酸酯 |
13.42 |
447.2/401.1 |
-45 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
|
|
447.2/371.2 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
可的松醋酸酯 |
12.30 |
445.2/339.1 |
-40 |
-10 |
-16 |
-9 |
|
|
|
445.2/369.3 |
-45 |
-10 |
-16 |
-9 |
注：帶"____"的監測離子對為定量離子對。
結果與討論
凈化條件的選擇
目前文獻報道的凈化方法多選用聚合物基質(zhì)的吸附性材料或硅膠基質(zhì)的ODS SPE小柱。本文選用CLeanert PEP-2 SPE小柱，實(shí)驗結果表明其可同時(shí)對11種糖皮質(zhì)激素有很好的吸附。
考察了不同體積分數0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%乙腈的水溶液的洗脫效果，結果表明使用10%乙腈的水溶液，可保證11種糖皮質(zhì)激素不被洗脫下來(lái)，所以最終選用10%乙腈的水溶液做淋洗液，并且在上樣之前要用水將乙腈的提取液稀釋。
液相色譜柱的選擇
在本文要同時(shí)檢測的11種糖皮質(zhì)激素中，可的松和氫化可的松、倍他米松和地塞米松為同分異構體，在反相液相色譜中比較難分離。通過(guò)比較不同C18的分離效果，最終選用VenusiLASB C18（3μm，150?，2.1 × 150mm）為色譜柱，可保證11種糖皮質(zhì)激素在15min內均達到基線(xiàn)分離。
線(xiàn)性關(guān)系和檢出限
將濃度分別為2、5、10、20和50μg/L的混合標準溶液依次進(jìn)樣分析，以峰面積Y對濃度X（μg/L）擬合回歸方程，結果見(jiàn)表6。結果表明，11種糖皮質(zhì)激素分別在2-50μg/L范圍內呈線(xiàn)性，相關(guān)系數r大于0.999，檢出限（S/N=3）為
表6 11種糖皮質(zhì)激素線(xiàn)性回歸方程和檢出限
|
藥物名稱(chēng) |
線(xiàn)性方程 |
r |
|
潑尼松 |
Y=16724X-210.43 |
0.9991 |
|
潑尼松龍 |
Y=23142-11999 |
0.9992 |
|
可的松 |
Y=16727-9533.1 |
0.9998 |
|
氫化可的松 |
Y=11244X+692.17 |
0.9992 |
|
甲基潑尼松龍 |
Y=16312X-15347 |
0.9992 |
|
倍他米松 |
Y=10695X-6738.1 |
0.9994 |
|
地塞米松 |
Y=22636-9558 |
0.9994 |
|
可的松醋酸酯 |
Y=8486.7X+2690.1 |
0.9994 |
|
潑尼松醋酸酯 |
Y=10652X-7839.4 |
0.9997 |
|
氫化可的松醋酸酯 |
Y=4372X-2405.8 |
0.9995 |
|
曲安奈德 |
Y=4062.9X-29840 |
0.9992 |
準確度和重現性
以市售玫瑰精油和護手霜為基質(zhì)，進(jìn)行添加回收實(shí)驗，進(jìn)行0.1μg/g和0.05μg/g添加濃度的實(shí)驗，11種糖皮質(zhì)激素的回收率均在75%-120%之間，具體實(shí)驗結果請見(jiàn)下列表格：
表7 玫瑰精油0.1μg/g添加回收實(shí)驗結果
|
藥物名稱(chēng) |
平行1 |
平行2 |
平行3 |
平均回收率 |
RSD |
|
潑尼松 |
85.19% |
85.65% |
76.98% |
82.61% |
5.90% |
|
潑尼松龍 |
91.68% |
90.70% |
81.07% |
87.82% |
6.68% |
|
可的松 |
93.67% |
92.11% |
82.38% |
89.39% |
6.84% |
|
氫化可的松 |
84.56% |
89.38% |
86.89% |
86.94% |
2.77% |
|
甲基潑尼松龍 |
94.08% |
82.90% |
84.75% |
87.24% |
6.87% |
|
倍他米松 |
89.74% |
90.28% |
80.51% |
86.84% |
6.33% |
|
地塞米松 |
103.10% |
93.90% |
89.10% |
95.37% |
7.46% |
|
可的松醋酸酯 |
87.19% |
87.40% |
92.02% |
88.87% |
3.07% |
|
潑尼松醋酸酯 |
119.07% |
119.86% |
111.63% |
116.85% |
3.89% |
|
氫化可的松醋酸酯 |
91.12% |
91.69% |
87.43% |
90.08% |
2.57% |
|
曲安奈德 |
98.72% |
84.57% |
87.15% |
90.14% |
8.36% |
表8玫瑰精油0.05μg/g添加回收實(shí)驗結果表
|
藥物名稱(chēng) |
平行1 |
平行2 |
平行3 |
平均回收率 |
RSD |
|
潑尼松 |
78.32% |
75.44% |
86.69% |
80.15% |
7.29% |
|
潑尼松龍 |
85.75% |
85.75% |
86.16% |
85.88% |
0.28% |
|
可的松 |
86.99% |
77.29% |
88.46% |
84.25% |
7.20% |
|
氫化可的松 |
72.36% |
69.15% |
75.04% |
72.18% |
4.08% |
|
甲基潑尼松龍 |
84.80% |
88.74% |
99.95% |
91.16% |
8.62% |
|
倍他米松 |
76.19% |
85.32% |
95.32% |
85.61% |
11.18% |
|
地塞米松 |
80.38% |
79.99% |
90.64% |
83.67% |
7.22% |
|
醋酸酯可的松 |
86.52% |
93.17% |
107.36% |
95.68% |
11.13% |
|
潑尼松醋酸酯 |
119.39% |
107.72% |
111.49% |
112.87% |
5.28% |
|
氫化可的松醋酸酯 |
94.54% |
110.02% |
103.75% |
102.77% |
7.58% |
|
曲安奈德 |
94.10% |
73.98% |
90.74% |
86.27% |
12.49% |
|
|
|
|
|
|
|
9護手霜0.1μg/g添加回收實(shí)驗結果
實(shí)驗結論
使用CLeanertTM PEP-2、VenusiLTM ASB C18建立了一種化妝品中11種糖皮質(zhì)激素同時(shí)檢測的分析方法，實(shí)驗結果表明本方法快速、準確，可用于化妝品中糖皮質(zhì)激素的檢測。
參考文獻
【1】鄭星泉，周淑玉，周世偉?；瘖y品衛生檢驗手冊。北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.294
【2】化妝品衛生規范。2007.34
【3】左志輝，周建玉，左文堅。藥物分析雜志。2004,24（4）：420
【4】張林，孫子林。中國藥物與臨床。2006,6（1）：76
附圖
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